TwistAmp 重組酶聚合酶擴(kuò)增法（RPA）快速檢測(cè)

默瑞生物推出現(xiàn)貨（TwistAmp Liquid Basic kit/TwistAmp EXO kit）液態(tài)重組酶聚合酶擴(kuò)增 (RPA)試劑盒，這些試劑盒非常適合需要不使用熱循環(huán)儀就能在15分鐘內(nèi)完成 DNA/RNA 擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)室以及想要靈活構(gòu)建試驗(yàn)體系的研究人員使用。

TwistAmp® Liquid試劑盒提供經(jīng)甘油穩(wěn)定化處理的液態(tài)RPA試劑，該形態(tài)對(duì)于在實(shí)驗(yàn)室執(zhí)行 PCR 和其他基于酶的反應(yīng)的任何人來(lái)說(shuō)都非常熟悉。這些試劑各自裝于單獨(dú)的試管中，用戶可隨意從中移取任何量的酶混合液來(lái)構(gòu)建自己所選的RPA反應(yīng)體積，配制用于多次反應(yīng)的預(yù)混液，或者以各種 RPA 組分比例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以優(yōu)化試驗(yàn)。

除了具有室溫穩(wěn)定性的凍干態(tài)TwistAmp® RPA試劑盒這一旗艦產(chǎn)品，本次新推出的 TwistAmp® Liquid試劑盒是現(xiàn)場(chǎng)或定點(diǎn)試驗(yàn)開(kāi)發(fā)的理想之選。液體形態(tài)讓實(shí)驗(yàn)室更容易地在日常工作中使用快速簡(jiǎn)單的RPA法（該方法有時(shí)甚至采用與PCR相同的引物）取代 PCR法，以及更容易地開(kāi)發(fā)出定制的試驗(yàn)。

TwistAmp利用RPA恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)發(fā)表的論文

Development of real-time reverse transcription recombinase polymerase amplification (RPA) for rapid detection of peste des petits ruminants virus in clinical samples and its comparison with real-time PCR test 實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA）的研究進(jìn)展

重組酶聚合酶擴(kuò)增法（RPA）快速檢測(cè)

3.非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(RPA)檢測(cè)方法的建立

HADENG Chu-riya1,2, FAN Xiao-xu1, ZHAO Yong-gang1, WANG Shu-juan1, ZHANG Zhi-cheng1, GE Sheng-qiang1, LI Lin1, WU Xiao-dong1, WANG Zhi-liang1   

1. National Research Center for Exotic Animal Disease, China Animal Health and Epidemiology Center, Qingdao 266032, China;
2. College of Veterinary Medicine, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病,給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失.本研究利用重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(RPA),針對(duì)ASFV B646L(p72)基因設(shè)計(jì)了3組引物和探針,并進(jìn)行篩選、反應(yīng)條件優(yōu)化、靈敏性、特異性和重復(fù)性試驗(yàn),建立了實(shí)時(shí)熒光RPA方法.結(jié)果顯示,該方法在39℃、20 min內(nèi)即可檢測(cè)10個(gè)拷貝的DNA分子,且與豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病病毒均無(wú)交叉反應(yīng),檢測(cè)5.5×106至5.5×100拷貝/μL共7個(gè)稀釋度樣品在各時(shí)間點(diǎn)的熒光強(qiáng)度,變異系數(shù)范圍在0.38％～28.30％.該等溫、快速擴(kuò)增方法可用于ASFV的定性檢測(cè),為中國(guó)ASFV感染的早期診斷提供技術(shù)支持,對(duì)疫情暴發(fā)后相應(yīng)控制方案的制定具有重要意義.

重組酶聚合酶擴(kuò)增法（RPA）-一種簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)的貓皰疹病毒-1特異性檢測(cè)方法

· Jianchang Wang,

· Libing Liu,

· Jinfeng Wang,

· Xiaoxia Sun,

Wanzhe Yuan 

2. 監(jiān)測(cè)HIV的新型移動(dòng)DNA檢測(cè)技術(shù)（RPA技術(shù)）

2014年6月9 訊 /生物谷BIOON/ --近日，刊登在雜志Analytical Chemistry上的一篇研究報(bào)告中，來(lái)自美國(guó)萊斯大學(xué)的科學(xué)家通過(guò)研究開(kāi)發(fā)了一種簡(jiǎn)便高準(zhǔn)確率的檢測(cè)技術(shù)，來(lái)檢測(cè)患者機(jī)體中的HIV跡象及病情發(fā)展程度。

研究者Rebecca Richards-Kortum表示，當(dāng)前用于診斷嬰兒HIV狀況的金標(biāo)準(zhǔn)就是依賴實(shí)驗(yàn)室設(shè)備及當(dāng)前可用的檢測(cè)技術(shù)來(lái)對(duì)其機(jī)體中的病毒載量進(jìn)行監(jiān)測(cè)，而本文中研究者則開(kāi)發(fā)出了基于核酸的新型HIV檢測(cè)技術(shù)。

這項(xiàng)新型的檢測(cè)技術(shù)基于PCR的方法對(duì)重組聚合酶進(jìn)行放大（RPA），從而取代了復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)步驟，其可以對(duì)血液中的遺傳標(biāo)記物進(jìn)行快速多重放大，從而使得病毒的遺傳標(biāo)記物可以很容易被檢測(cè)到；利用qRPA檢測(cè)就可以對(duì)HIV DNA中的特殊序列進(jìn)行熒光探針的靶向標(biāo)記，從而使用機(jī)器進(jìn)行定量檢測(cè)，后通過(guò)對(duì)熒光DNA進(jìn)行軟件分析就可以使得醫(yī)生們掌握HIV在患者機(jī)體中的動(dòng)態(tài)信息。

Rohrman教授說(shuō)道，我們可以通過(guò)放大內(nèi)部陽(yáng)性對(duì)照對(duì)測(cè)試進(jìn)行校準(zhǔn)，而且可以利用HIV序列的相同引物進(jìn)行擴(kuò)增，因此檢測(cè)實(shí)驗(yàn)可以正常進(jìn)行；這項(xiàng)新型技術(shù)可以幫助追蹤老年患者機(jī)體中的病毒載量，這對(duì)于臨床醫(yī)生們實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)病人體內(nèi)的HIV情況，從而來(lái)確定患者是否需要及時(shí)治療提供了一定的參考數(shù)據(jù)。

從臨床角度來(lái)講，基于DNA的HIV檢測(cè)可以在四個(gè)數(shù)量級(jí)上對(duì)HIV的病毒載量進(jìn)行定量檢測(cè)，盡管當(dāng)前研究者使用熱循環(huán)儀來(lái)進(jìn)行檢測(cè)，但是研究者正在著力開(kāi)發(fā)一種新型的檢測(cè)技術(shù)，使得整個(gè)操作步驟維持在室溫和體溫之間，從而確保實(shí)驗(yàn)的通用性和準(zhǔn)確性。

附: TwistAmp liquid試劑盒Q&A

Q 20x核心反應(yīng)mix有沉淀,是否影響其功能?

A在低溫保存時(shí), 重組酶和輔助蛋白在50%甘油中20x核心反應(yīng)mix中有時(shí)會(huì)發(fā)生可逆的共沉淀反應(yīng).所以在室溫融化混勻后離心使其返回溶液形式并不影響其功能。

Q 使用Liquid試劑盒做多重實(shí)驗(yàn)，能否制備master mix?

A 可以。Oligos, 2x Reaction Buffer, water, dNTPs and 10x E-mix可以預(yù)先混合，置于冰上幾個(gè)小時(shí)，在很多實(shí)例中可以過(guò)夜保存（性能上有任何改變都需要客戶自行實(shí)驗(yàn)和評(píng)價(jià)）。一旦加入20x核心酶，短期保存在冰上也是可以的。

Q 使用Liquid試劑盒如何提高重復(fù)率和RNA模板的擴(kuò)增率?

A 先將RNA模板和醋酸鎂混合后加入反應(yīng)體系中，RNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)抑制逆轉(zhuǎn)錄酶的活性，所以加入RNA和醋酸鎂時(shí)，將兩者分別加到在管內(nèi)壁兩側(cè)或者將醋酸酶加在管內(nèi)蓋中，同時(shí)離心混入體系，這種操作會(huì)提高反應(yīng)性能。

Q 在TwistAmp Liquid E-mix中有沉淀，還能使用嗎?

A 可以。少量磷酸肌酸會(huì)發(fā)生沉淀不會(huì)影響RPA反應(yīng)，只需在實(shí)驗(yàn)前通過(guò)渦旋將沉淀重懸離心即可。

Q 在使用Liquid試劑盒時(shí)，是否能夠使用dUTP/生物素（酰）化dUTP?

A 可以，請(qǐng)參考

Q 小的RPA液體反應(yīng)體系是多少?

A 小低至PL級(jí)，請(qǐng)參考

Q 液體反應(yīng)體系中需要加入多少dNTPs?

A 1.8mM(總)dNTPs 作為起始量即可。用戶也可以根據(jù)自身實(shí)驗(yàn)優(yōu)化濃度,有時(shí)1-12mM均適用。

Q 如何提高擴(kuò)增曲線的可重復(fù)性?

A 優(yōu)化擴(kuò)增曲線考慮以下因素: 對(duì)于低拷貝數(shù)模板，不穩(wěn)定擴(kuò)增可能是因?yàn)檫_(dá)到檢測(cè)限或者是反應(yīng)混勻程度不同（未混勻的反應(yīng)擴(kuò)增效率不佳）。另外，在低溫情況下存貯，重組酶和輔助蛋白在50%甘油情況下形成沉淀,也是可能導(dǎo)致不穩(wěn)定擴(kuò)增的原因。所以，20x核心反應(yīng)mix在室溫下解凍并震蕩渦旋將使其成為液體，不影響其功能,并且有效提高擴(kuò)增效率。不穩(wěn)定擴(kuò)增也可能是因?yàn)閙aster mix量不足，在加入體系前，用戶必須保證震蕩后20x核心反應(yīng)組分均一。
默瑞生物

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