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在這里,我們介紹TwistAmp®液體,一種新的PCR替代形式,使RPA技術(shù)更適用于廣泛的研究應(yīng)用。與PCR擴(kuò)增相比,RPA只需幾分鐘,而不是幾個小時,可以運行不需要額外設(shè)備。TwistAmp®Liquid Basic和Basic試劑盒可用于需要良好保真度,凝膠電泳或固相檢測的應(yīng)用。TwistAmp®Liquid exo和exo允許快速實時擴(kuò)增和檢測目標(biāo)而不犧牲靈敏度或特異性。
概述
圖1:RPA循環(huán),重組酶蛋白與引物形成重組絲,并將其插入DNA雙螺旋的互補位點,形成d環(huán)。單鏈dna結(jié)合(SSB)蛋白穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)和d環(huán)的開放。重組酶的分解允許鏈置換聚合酶沿著目標(biāo)序列延伸引物的3端。當(dāng)對相反的引物重復(fù)這個序列時,指數(shù)擴(kuò)增發(fā)生而不需要熱變性或退火。
自2008年推出以來,TwistAmp®試劑盒為科學(xué)家提供了一種簡單的方法來進(jìn)行重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA),迄今為止已有250多篇關(guān)于該技術(shù)的同行評審出版物。RPA是一種等溫替代聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的方法,它使用三種蛋白質(zhì)(重組酶,單鏈dna結(jié)合蛋白和鏈置換聚合酶)來代替熱循環(huán)(圖1)。RPA在恒定低溫下(理想情況下為37-42°C)效果,反應(yīng)速度非常快(反應(yīng)時間小于20分鐘),可以用穩(wěn)定的凍干顆粒啟動,這使得它非常適合即時測試。此外,RPA用戶已經(jīng)在各種不同的應(yīng)用中測試了TwistAmp®試劑盒試劑,包括那些傳統(tǒng)上使用PCR的試劑(如最近對RPA應(yīng)用的回顧所述1)。與PCR一樣,簡單的RPA使用兩種相反的引物以指數(shù)方式擴(kuò)增DNA的特定區(qū)域。RPA引物對遵循與PCR引物相似的設(shè)計規(guī)則,并且為PCR反應(yīng)開發(fā)的引物通常在RPA反應(yīng)中表現(xiàn)良好。
關(guān)于TwistAmp®Liquid試劑盒
為了鼓勵這種多為了鼓勵這種多用途的RPA技術(shù),TwistDx™開發(fā)并推出了TwistAmp®液體試劑盒,為用戶提供更靈活的試劑。TwistAmp®Liquid試劑盒類似于在每個分子生物學(xué)實驗室冷凍室中發(fā)現(xiàn)的預(yù)制PCR master mixes,包括核心RPA蛋白混合物的甘油儲存管,一管緩沖液,一管驅(qū)動重組過程所需的能量混合物和一管用于蛋白質(zhì)的醋酸鎂輔助因子。
有四種TwistAmp®液體試劑盒可用:基本和基本RT擴(kuò)增無探針,適用于凝膠電泳,固相擴(kuò)增和微陣列應(yīng)用與尾部引物和適配體;exo和exo RT,它們與基于探針的實時檢測方法兼容。所有四個試劑盒包含相同的核心反應(yīng)混合物,重組酶,單鏈結(jié)合蛋白和鏈置換聚合酶的比例與凍干的TwistAmp®基本試劑盒相同。因此,當(dāng)使用液體試劑盒時,使用凍干的TwistAmp®基本試劑盒進(jìn)行的分析當(dāng)然應(yīng)該表現(xiàn)得非常相似,但使用其他凍干的TwistAmp®試劑盒進(jìn)行的分析在使用液體試劑盒時可能會顯示出不同的分析性能。圖2顯示:使用TwistAmp®exo RT和TwistAmp®Liquid exo RT進(jìn)行的檢測均檢測到50份人呼吸道合胞病毒B RNA模板。除了Core Reaction Mix外,exo試劑盒還包含一管外切酶III,用于處理TwistAmp®外切酶探針進(jìn)行實時熒光檢測,RT試劑盒包含一管逆轉(zhuǎn)錄酶,用于將RNA單步轉(zhuǎn)化為cDNA并隨后擴(kuò)增。
TwistAmp®液體試劑盒,類似于他們的凍干對應(yīng)試劑盒,配制允許擴(kuò)增片段高達(dá)500個堿基對的大小,這足以用于許多常見的PCR實驗室用途(不同的蛋白質(zhì)制劑正在開發(fā),以允許更長的擴(kuò)增子)。這使得RPA成為許多標(biāo)準(zhǔn)實驗室克隆和測序方案中取代PCR的優(yōu)秀候選者。當(dāng)用于Illumina下一代測序文庫制備時,RPA比校對聚合酶(如Kapa HiFi和Platinum pfx2)導(dǎo)致的錯誤更少。此外,在為合成生物學(xué)開發(fā)的端到端自動化微流控平臺上,利用Gibson克隆的等溫變體,RPA已被用于生成更長的754堿基對片段,從而證明了在已建立的聚焦pcr方案中成功實施RPA。
TwistAmp®Liquid試劑盒優(yōu)勢
與凍干的TwistAmp®試劑盒相比,TwistAmp®Liquid的一個關(guān)鍵優(yōu)勢是,科學(xué)家可以根據(jù)需要使用盡可能多或盡可能少的TwistAmp®試劑,在他們選擇的容器中進(jìn)行反應(yīng)。與PCR不同的是,RPA是等溫的,在相對較低的最佳溫度下工作,并且可以耐受過低溫度和溫度波動。在將主混合物輸送到反應(yīng)體系之前不需要預(yù)熱,并且在較低的等溫溫度下,蒸發(fā)和冷凝的影響不是主要問題。這意味著在小的、分區(qū)的微流體裝置體積中的熱控制得到了簡化:RPA已被證明可以在非常小的(皮升)體積中工作4。RPA的這些屬性也意味著它可以用于比PCR理想的更大體積的反應(yīng)。圖3顯示:一對PCR引物5成功擴(kuò)增了淋病奈瑟菌269堿基對片段,反應(yīng)量為2.5 ~ 5000微升。因此,TwistAmp®液體反應(yīng)可以在從定制的微流體裝置到標(biāo)準(zhǔn)實驗室96孔板到微離心管,甚至更大的容器中運行。
選擇TwistAmp®液體試劑盒而不是凍干TwistAmp®試劑盒的科學(xué)家有更多的選擇性,因為TwistAmp®液體試劑盒不包括脫氧核糖核苷酸三磷酸(dNTPs)。因此,可以用三磷酸脫氧尿苷(dUTP)或標(biāo)記的核苷酸進(jìn)行檢測,以允許擴(kuò)增子捕獲或比色或電化學(xué)檢測6 - 8。
總結(jié)
RPA已在250多項外部研究中得到應(yīng)用,并在眾多應(yīng)用和領(lǐng)域中越來越具有優(yōu)勢。我們的新型TwistAmp®液體是實驗室分子生物學(xué)研究中第一個可行的PCR替代品。
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默瑞生物
默瑞(上海)生物科技有限公司,作為專業(yè)的生命科學(xué)產(chǎn)品推廣與服務(wù)商,以“創(chuàng)新,專業(yè),共贏"的理念,不斷強(qiáng)化服務(wù)體系,提升客戶體驗,結(jié)合國內(nèi)外優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品提供高標(biāo)準(zhǔn)完整解決方案,幫助科研客戶和生物技術(shù)企業(yè)高效創(chuàng)新,加速轉(zhuǎn)化,創(chuàng)造更多優(yōu)質(zhì)產(chǎn)品,提升社會福祉,實現(xiàn)多方共贏。
默瑞生物創(chuàng)立以來,已經(jīng)陸續(xù)導(dǎo)入TwistDx,enzymatics,KAPA BIOSYSTEMS,BioDynami,Jackson,Echelon,ChromoTek,Nanocs,Biotechrabbit,Lee Biosolutions, magtivio,美的醫(yī)療冰箱,新華醫(yī)療,FOUR E'S科學(xué)儀器等優(yōu)質(zhì)國際品牌,逐步培育成為專業(yè)用戶的選擇。
代理試劑產(chǎn)品有:TwistDx恒溫擴(kuò)增試劑盒,Echelon脂類研究試劑,KAPA BIOSYSTEMS二代測序試劑, Enzymatics二代測序酶,Jackson ImmunoResearch抗體,ChromoTek熒光蛋白及抗體,Horizon Discovery測序標(biāo)準(zhǔn)品,Biomatik公司Elisa試劑盒,Nanocs PEG修飾劑,Spectrumlabs透析袋,Polysciences微球,JenaBioscience分子試劑,Lifespan Technologies硫酸葡聚糖ELISA試劑盒及抗體,Lee Biosolutions抗體,Emfret心血管研究抗體,Magtivio B.V.DNA提取磁珠,Biontex Laboratories轉(zhuǎn)染試劑,Eppendorf,Canvax™細(xì)胞凋亡檢測試劑盒,Matriks Biotek®生物藥物檢測試劑盒,Immunostep流式細(xì)胞術(shù)抗體,F(xiàn)uller Laboratories感染性疾病檢測試劑盒,SICGEN抗體,biotechrabbit酶及抗體等。