發(fā)布時(shí)間： 2021-12-20 點(diǎn)擊次數(shù)： 1268次
隨著PCR技術(shù)的發(fā)展與廣泛應(yīng)用，利用PCR的定量技術(shù)也取得了長(zhǎng)足的發(fā)展。早期主要采用外參照的定量PCR方法，這種方法因影響因素較多，現(xiàn)已逐漸被內(nèi)參照物定量方法和競(jìng)爭(zhēng)PCR定量方法所取代，并在此基礎(chǔ)上發(fā)展了熒光定量
PCR儀方法，使PCR定量技術(shù)提升到新的水平。
分子信標(biāo)技術(shù)也是在同一探針的兩末端分別標(biāo)記熒光分子和猝滅分子。通常，分子信標(biāo)探針長(zhǎng)約25核苷酸，空間上呈莖環(huán)結(jié)構(gòu)。與TaqMan探針不同的是，分子信標(biāo)探針的5'和3'末端自身形成一個(gè)8個(gè)堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，此時(shí)熒光分子和猝滅分子鄰近，因此不會(huì)產(chǎn)生熒光。當(dāng)溶液中有特異模板時(shí)，該探針與模板雜交，從而使探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開(kāi)，于是溶液便產(chǎn)生熒光。熒光的強(qiáng)度與溶液中模板的量成正比，因此可用于PCR儀的定量分析。該方法的特點(diǎn)是采用非熒光染料作為猝滅分子，因此熒光本底低。
常用的熒光猝滅分子對(duì)是5'-（2'-氨乙基氨基萘-1-磺酸）（EDANS）和4'-（4'-二甲基氨基疊氮苯）苯甲酸（DAB-CYL），采用DAB-CYL作猝滅劑是由于它對(duì)多種熒光素都有很強(qiáng)的猝滅效率。當(dāng)受到336nm紫外光激發(fā)時(shí)，EDANS發(fā)出波長(zhǎng)為490nm的亮藍(lán)熒光；DAB-CYL的是非熒光分子，但其吸收光譜與EDANS的發(fā)射熒光光譜重疊。只有分子信標(biāo)時(shí)，EDANS和DAB-CYL的距離非常接近，足以發(fā)生FRET，EDANS受激發(fā)產(chǎn)生的熒光轉(zhuǎn)移給DAB-CYL并以熱的形式散發(fā)，不能檢測(cè)到熒光；相反，當(dāng)有靶核酸存在時(shí)才可檢測(cè)到熒光。
分子信標(biāo)技術(shù)的不足之處是：
雜交時(shí)探針不能*與模板結(jié)合，因此穩(wěn)定性差；
探針合成時(shí)標(biāo)記較復(fù)雜。分子信標(biāo)技術(shù)結(jié)合不同的熒光標(biāo)記，可用于基因多突變位點(diǎn)的同時(shí)分析。
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